Thứ sáu, Ngày 22 Tháng 09 Năm 2017
  • Chào mừng các bạn đến với Trang tin điện tử Bệnh viện Phong - Da liễu Trung ương Quy Hòa!
Trang chủTìm kiếmSơ đồ trangLiên hệEnglish
Liên kết
  Đang truy cập: 75  
 
1 1 7 0 7 7 8 4
 
 
 
Chuyên đề KCB Sinh học phân tử

VIRUS DENGUE và kỹ thuật SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN   
                                                                 Bùi Thị Bích Thoa 
 
Sốt Dengue và sốt xuất huyết (SXH) Dengue gây nên bởi một trong bốn loại virus có type huyết thanh khác nhau về mặt kháng nguyên (serotype) là DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Khi nhiễm một serotype nào của virus Dengue thì cơ thể có khả năng tạo miễn dịch suốt đời đối với chính serotype đó, vì vậy mà người bệnh có thể mắc nhiều serotype virus Dengue trong đời.
 
Dịch tễ học
Theo tổ chức Y tế thế giới, khoảng 40% dân số thế giới có nguy cơ mắc SXH, và có khoảng 50-100 triệu người trên thế giới nhiễm SXH mỗi năm [11],[12].
 
Sốt Dengue và SXH đã xuất hiện ở hơn 100 quốc gia như châu Phi, châu Mỹ, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương. Trong đó, Mỹ, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. SXH không chỉ đáng lo về số trường hợp nhiễm gia tăng mà còn đáng lo về mức độ lây truyền vector gây bệnh lẫn nhau từ các vùng địa lý [6], [11], [12].
 
Tình hình nhiễm SXH ở Việt Nam không ổn định nhưng thời kỳ cao điểm của dịch là từ  tháng 6-10 hàng năm. Trong đó trên 85% ca mắc và 90% ca tử vong do SXH là ở các tỉnh miền Nam, khoảng 90% ca tử vong ở nhóm tuổi dưới 15 [3]. Dịch SXH thường xảy ra theo chu kỳ từ 3-5 năm một lần. Ở Việt Nam, vector gây bệnh SXH có mật độ cao và phân bố địa lý lớn, có sự lưu hành của cả bốn loại type huyết thanh gây SXH. Thêm vào đó là nguồn cung cấp nước sạch ở các vùng nông thôn, điều kiện vệ sinh, hệ thống xử lý nước thải kém càng làm tăng mật độ vector gây bệnh SXH, đồng thời cản trở việc kiểm soát sự lan truyền của muỗi Aedes aegypti và SXH.
 
1.CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS DENGUE
- Virus Dengue thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae, mang đặc điểm của Arbovirus (Arthropod born virus), có cấu trúc hình khối đa diện, nhóm IV (+) ssRNA gồm 11000 nucleotide, chứa khung đọc mở duy nhất mã hoá cho 10 loại protein của virus: 3 loại protein cấu trúc C, prM, E và 7 loại protein không cấu trúc (non structure - NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5.
 
Hình 1: Sơ đồ cấu trúc protein của virus Dengue. Nguồn Internet
 
    + Protein C - Protein capsid chứa 112-113 acid amine
    + Protein prM (premembrane) - tiền thân của protein màng
    + Protein E (envelope) - protein vỏ ngoài được glycosyl hoá để thành glycoprotein, gồm 493-495 acid   amine
    + NS1 là glycoprotein, kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng       miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus. NS1 của virus Dengue có trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2 dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài. Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác định đầy đủ, nhưng người ta nhận thấy nó tham gia vào quá trình sao chép RNA của virus, cần thiết cho sự tồn tại của virus [7].
 
    + NS2 là protein có kích thước lớn
       NS2A là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.
      NS2B là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ. Vùng trung tâm của NS2B như là đồng yếu tố của protein NS3 có hoạt tính serine protease.
   + NS3 là protein có hoạt tính serin-protease và helicase. Mã amin cuối cùng của NS3 là serine protease, cần thiết cho quá trình sao chép của virus.
    + NS4A là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.
    + NS4B là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.
 
- Virus Dengue hình cầu, đường kính 35-50nm, đối xứng khối. Vỏ ngoài là lớp lipide kép (vì vậy mà nó nhạy cảm với các dung môi hoà tan lipide, virus bị phá huỷ bởi tia cực tím, bị tiêu diệt ở 600C/30 phút, 40C/ vài giờ nhưng nó tồn tại được vài tháng đến vài năm trong dung dịch glycerol 50% hay ở -700C) chứa glycoprotein và protein có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào. Vỏ capsid bao quanh acid nucleic tạo thành nucleocapsid có đường kính 30nm, chứa 32 capsome.
 
 
- Virus Dengue có kháng nguyên kết hợp bổ thể, trung hòa và ngăn ngưng kết hồng cầu. Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia virus Dengue ra làm 4 type khác nhau. Mặc dù 4 type Dengue có tính chất kháng nguyên khác nhau nhưng chúng có một số quyết định kháng nguyên chung, nhất là các kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu, nên chúng có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các type.
 
- Quá trình nhân lên của virus
Virus Dengue xâm nhập vào tế bào bằng con đường dung hợp (fusion) và chủ yếu nhân lên ở đại thực bào. Genome RNA(+) làm nhiệm vụ mRNA gắn vào ribosome của tế bào chủ mã hoá cho một phân tử polyprotein duy nhất. Nhờ protease, phân tử polyprotein này bị phân cắt thành 10 đoạn, trong đó có RNA-polymerase (đóng vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã).
 
 
 
1. CHẨN ĐOÁN VIRUS DENGUE.
1.1  Các xét nghiệm cận lâm sàng trong hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi SXH.
- Các chỉ số huyết học: số lượng tiểu cầu, thời gian máu chảy máu đông, thể tích hồng cầu.
- Các chẩn đoán miễn dịch:
Phát hiện kháng thể:
·Thử nghiệm nhanh bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch: Sự phát triển của xét nghiệm nhanh có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG trở nên thuận tiện. Tuy nhiên, thời điểm chỉ định xét nghiệm, độ đặc hiệu, độ nhạy của thử nghiệm không cao là các vấn đề cần cân nhắc khi sử dụng thử nghiệm này.
 
·Kỹ thuật phát hiện kháng thể như: ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibitation - HI), kỹ thuật trung hòa mảnh bám (Plaque Reduce Neutralization test - PRNT), kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn men (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA), kỹ thuật cố định bổ thể (Complement Fixation - CF). Hầu hết các phản ứng miễn dịch này chỉ được tiến hành sau khi có sự gia tăng mức kháng thể. Vì vậy khả năng bỏ sót chẩn đoán bệnh do nồng độ IgM thấp hay không được phát hiện trong nhiễm thứ phát, thời điểm lấy máu cũng cần được xem xét vì có thể không phát hiện được kháng thể trong những ngày đầu của sốt, kháng thể cao nhất có được khi đó các biểu hiện lâm sàng cũng khá rõ ràng.
  
 
Phát hiện kháng nguyên
·Gần đây thử nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 cũng đã được sử dụng hiệu quả, kháng nguyên NS1 được chứng minh lưu thông trong máu ngay sau khi sốt và còn tiếp tục có trong máu cho đến ngày sốt thứ 9, kháng nguyên này được tìm thấy trước khi có kháng thể IgM. Tuy nhiên về độ đặc hiệu của NS1 trong một số bệnh lý nhiễm virus khác cũng đã được các nhà lâm sàng cân nhắc khi sử dụng.
 
·Kỹ thuật phân lập virus: là tiêu chuẩn vàng của chẩn đoán xét nghiệm nhiễm virus Dengue, thường được sử dụng trong các nghiên cứu cơ bản về virus, dịch tể học và sinh bệnh học. Việc phân lập virus trên các dòng tế bào đặc hiệu đòi hỏi thời gian ít nhất là 1 tuần và làm tăng chi phí điều trị cho bệnh nhân, phương pháp này chỉ phù hợp trong nghiên cứu.
 
1.2  Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán nhiễm virus Dengue và các tính năng ưu việt của nó.
Kỹ thuật Sinh học phân tử ngày nay đã được áp dụng rộng rãi vào Y tế có vai trò quyết định chẩn đoán, điều trị và nghiên cứu trong một số bệnh nhiễm vi khuẩn, virus, vì tính đặc hiệu và độ nhạy cao [2], [5], [8], [9], [10].
 
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) xác định và định type virus Dengue là kỹ thuật khuếch đại RNA của virus Dengue bằng các đoạn mồi đặc hiệu thông qua giai đoạn tổng hợp cDNA từ RNA.
    
Kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên NS1 nhằm xác định có hay không có virus Dengue trong máu người bệnh là phương pháp xác định nhanh chóng và chính xác ngay cả trong thời gian đầu nhiễm virus [8]. Do bản chất di truyền của virus Dengue là RNA (ribonucleic acid) nên đầu tiên phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp sợi cDNA từ RNA của virus nhờ enzyme Reverse Transcriptase; Sau đó, phản ứng PCR lần thứ I khuếch đại đoạn gen kháng nguyên nhằm xác định có hay không có virus Dengue trong máu bệnh nhân; Tiếp theo, phản ứng PCR đa mồi (Multiplex Semi-Nested PCR) lần thứ II với các đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu cho từng serotype của virus Dengue.
 
RT-PCR có thể cho kết quả sau 12h từ khi lấy bệnh phẩm. Có thể thực hiện ngay lúc virus xâm nhập vào cơ thể mà chưa hề có dầu hiệu giảm số lượng tiểu cầu hay cô đặc máu (hematorit tăng), hoặc khi bệnh nhân bắt đầu sốt, chưa có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng, các xét nghiệm miễn dịch xác định kháng thể IgM vẫn còn âm tính.
 
Việc định type virus Dengue có ý nghĩa dịch tễ lớn và đặc biệt là khả năng tiên lượng bệnh, tránh được hai bệnh cảnh nặng nề là SXH và sốc Dengue trong cơ chế miễn dịch tăng cường do bệnh nhân tái nhiễm virus Dengue type khác (đặc biệt là đối với vùng dịch tễ cao). Đây là một ứng dụng có giá trị về mặt dịch tễ phân tử và lâm sàng phân tử trong bệnh cảnh SXH và sốc Dengue. Bệnh cảnh trên xuất hiện khi kháng thể kháng một type virus gây sốt Dengue phản ứng với một type virus khác. Các kháng thể trên không có khả năng trung hòa nhiễm trùng ­­mà làm tăng khả năng gắn và xâm nhập của virus vào bạch cầu đơn nhân, gây sốt, xuất huyết, cô đặc máu, nếu không được chẩn đoán sớm và xử lý kịp thời có thể dẫn đến tử vong.
 
So với phương pháp nuôi cấy RT-PCR cho kết quả nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, ít tốn kém hơn. Đối với các trường hợp bệnh nhân nhiễm ít virus thì việc phân lập có thể cho kết quả âm tính thì RT-PCR cho thấy mức độ nhạy  và tin cậy hơn rất nhiều lần [8].
    
Về kinh phí, so với giá trị mà RT-PCR phát hiện và định type virus Dengue mang lại trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh và dịch tễ học thì thực sự không đắt so với kỹ thuật phân lập virus và kỹ thuật miễn dịch khác.
 
Mặc dù dịch tễ SXH tại khu vực miền Trung Tây nguyên không cao như các vùng khác trong cả nước. Tuy nhiên, theo một số báo cáo thì một số tỉnh thuộc khu vực miền Trung Tây nguyên có số ca mắc SXH tăng cao trong năm 2013 như Gia Lai, Kon Tum [6]. Thêm vào đó là sự lan truyền các type khác nhau vào các vùng địa lý cũng gây khó khăn cho công tác chẩn đoán, tiên lượng bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu về SXH Dengue  cũng như triển khai các kỹ thuật RT-PCR xác định và định type virus Dengue tại các vùng dịch tễ không cao đang là vấn đề cần thiết được thực hiện.
 
1.3  Kỹ thuật RT-PCR xác định và định type virus Dengue trong huyết thanh người bệnh được thực hiện tại Bệnh viện Phong – Da liễu TW Quy Hòa.
Quy trình được thực hiện theo quy trình RT-PCR xác định và định type virus Dengue tại Labo Arbovirus, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh với các primer đặc hiệu cho virus Dengue của Lanciotti trong chẩn đoán bệnh SXH [9].
 
Tóm tắt quy trình:
Ly trích RNA.
RNA của virus Dengue được ly trích từ huyết thanh bệnh nhân bằng hóa chất thích hợp, bảo quản – 800C.
 
Tổng hợp cDNA.
Thực hiện phản ứng sao chép ngược để tổng hợp trình tự DNA mạch kép từ sợi RNA mạch đơn.
 
Phản ứng PCR1 xác định virus Dengue.
Sử dụng mồi đặc hiệu của virus Dengue trên gene nonfuntional polyprotein cho sản phẩm khuếch đại 511 bp.
Hình 4: PCR1 phát hiện virus Dengue với kích thước 511bp
 
 
Phản ứng Multiplex PCR xác định type virus Dengue.
Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu của virus Dengue trên gene nonfuntional polyprotein. Sự khác nhau về trình tự mồi khuếch đại các sản phẩm PCR khác nhau có thể phân biệt trên gel điện di agrose cho phép xác định các serotype 1, 2, 3, 4 của virus Dengue.   
 
Hình 5: Semi – nested Multiplex PCR2 phát hiện các type virus Dengue
 

Tài liệu tham khảo.

 1.  Bộ Y tế (2009). Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue. Bộ Y tế ban hành.

2. Deubel, V., Laille, M., Hugnot, J.P., Chungue, E., Guesdon, J.L., Drouet, M.T., Bassot, S. And Chevrier (1990): Identification of dengue sequences by genomic amplification: rapid diagnosis of dengue virus serotypes in peripheral blood. J. Virol. Methods, 30: 41-54.

3. Do Quang Ha, Vu Thi Que Huong, Huynh Thi Kim Loan, Phan Kim Sac (1996): Dengue Haemorrhagic Fever in South Vietnam, 1991-1994. Dengue Bulletin, 20: 55-61.

4.  Monath T.P. (1994): Dengue: the risk to developed and developing cuontries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2395.

5.  Morita.K., Maemoto, T., Honda, S. Onishi, K., Murata, M., Tanaka, M., Igarashi, A (1994): Rapid detection of virus genome from imported dengue fever and dengue haemorrhagic fever patients by direct polymesrase chain reaction. J. Med. Virol., 44: 54-58.

6.  Nguyễn Xuân Quang, Đỗ Văn Nguyên. WHO: dự báo Sốt xuất huyết Dengue ở khu vực Tây Thái Bình Dương năm 2014. Ngày 19/02/2014.

7.  Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ. Elisa to detect NS1 antigen for the diagnosis of Dengue fever and Dengue haemorrhagic fever. Y học thành phố Hồ Chí Minh *Vol.13 – Supplement of  No1-2009: 249-255

8.  Phòng xét nghiệm Y khoa NK-BIOTECK (2009). Xét nghiệm phát hiện và định type Dengue để chẩn đoán sớm Sốt Dengue và Sốt xuất huyết Dengue.

9. Robert S. Lanciotti, Charles H. Calisher, Duane J. Gubler, Gwong-Jen Chang, and A. Vance Vorndam (1992): Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, Mar.1992, p. 545-551.

10. Vu Thi Que Huong, Huynh Thi Kim Loan, Do Quang Ha, Nguyen Trong Lan, Nguyen Thanh Hung, Vincent Deubel (1997): Detection of dengue virus by Reverse Transcription/Polymerase Chain Reaction. Med J HCM city, 2: 2-4 (in Vietnamese).

11. World health organization, 2013. Dengue hemorrhagic fever, diagnosis, treatment, prevention and control. Geneva: WHO Fact sheet No117, updated September 2013.

12. www.wpro.who.int/vietnam/topics/dengue/factsheet/en/.

 

Ngày 06/02/2015
 
[ In trang ][ Xem & in ][ Gửi mail ][ Đầu trang ][ Trở lại ]
 

THÔNG BÁO

 lich kcb

 

 Thông báo mời thầu gói thầu số 1 mua sắm TTBYT 2017

 

 Thông báo mời thầu gói thầu số 2 mua sắm TTBYT 2017

 

 Thông báo mời thầu gói thầu số 3 mua sắm TTBYT 2017

 

 Thông báo mời thầu gói 4 thầu số mua săm TTBYT

 
TÁC NGHIỆP
TIN VIDEO
Giới thiệu Bệnh viện
  Trang tin điện tử Bệnh viện Phong – Da liễu Trung ương Quy Hòa 
Giấy phép của Cục Báo chí – Bộ Văn hóa Thông tin số: 54/GP-BC ngày 01/03/2006
  Bản quyền: Bệnh viện Phong – Da liễu Trung ương Quy Hòa
 Tel: (84 56) 3747 999 – Fax: (84 56) 3646 344 – Email: quyhoandh2005@gmail.com